Иммунофлюоресцентное исследование для оценки результатов эндолечения. Результаты лечения хронического периодонтита премоляра с несформированным корнем

Значимость

В некоторых клинических случаях для устранения симптомов требуется более длительная дезинфекция корневых каналов перед проведением регенеративных эндодонтических процедур. В таких ситуациях при гистологическом анализе результатов лечения определяется репарация повреждённых структур, но не происходит их регенерации.

АННОТАЦИЯ

Введение: Исследования, заключавшиеся в иммунофлюоресцентном анализе формирования ткани при регенеративных эндодонтических процедурах (REP) на инфицированных человеческих зубах, имеют ограниченное распространение. В данном исследовании представлены результаты иммунофлюоресцентного гистологического анализа REP, при которых была достигнута необходимая дезинфекция корневых каналов.

Методы: Девочка, 11 лет, обратилась в клинику с жалобой на перелом зуба 29 (dens evaginatus) и образование свища. Для ликвидации симптоматики перед проведением REP потребовалась три визита в ходе котрых проводилась химико-механическая обработка корневых каналов. Через 12 месяцев на рентгенограмме апикальных изменений не определялось, однако отсутствовала динамика при проведении теста на чувствительность. Через 18 месяцев зуб был удалён по ортодонтическим показаниям. Для окрашивания сиалофосфопротеина (DSPP), остеопонтина (OPN), периостина и основного белка миелина, находящихся в дентине, были применены гистологические и иммунофлюоресцентные методы.

Результаты: При гистологическом исследовании регенерация пульпо-дентинного комплекса не определялась. Новая минерализованная ткань была связана с ранее существовавшими дентинными канальцами. Неодонтобласт-подобные клетки в зависимости от их месторасположения синтезировали разное количество OPN и DSPP. Клетки, располагавшиеся возле МТА, синтезировали DSPP и OPN, в то время как апикально расположенные клетки секретировали в основном OPN. Основной белок миелина был обнаружен в центральных слоях новообразованной ткани и отсутствовал в пришеечной трети корня. Периостин был обнаружен на всём  протяжении корневого канала, что свидетельствует о процессах репарации, а не регенерации.

Заключение: В данном исследовании показана эффективность регенеративных эндодонтических процедур на зубе с рецидивирующей инфекцией. Репаративный фенотип продемонстрирован посредством гистологических методов. Возможность регенерация пульпы de novo может быть ограничена в зависимости от факторов организма хозяина.

При проведении общепринятого эндодонтического лечения зубов с незаконченным формированием корня возникают трудности с проведением дезинфекции каналов, их обтурацией и долгосрочной структкрной стабильностью. Для обеспечения дальнейшего роста и формирования корня после гибели пульпы зуба была разработана парадигма регенеративных эндодонтических процедур (REP). В настоящее время знания о механизмах REP основаны на исследованиях на животных. Иммунофлюоресцентные гистологические исследования на человеческих зубах с проведённым REP достаточно редки. Тем не менее, такие исследования важны: появляется возможность изучить процессы заживления in vivo.

In vitro изучалось влияние различных препаратов и их концентраций на стволовые клетки, но такие исследования не описывали эффекта при повторении подобных процедур, физическую и клеточною микросреду при проведении REP. Таким образом, результат лечения после проведения данного протокола на гистологическом уровне не исследован. В клинической практике для ликвидации симптомов пред проведением REP может понадобиться несколько посещений с временным пломбированием антибактериальными препаратами. В большинстве случаев гистологически исследовали зубы, на которых при применении REP проводили только один визит для дезинфекции каналов.

В данной статье описано гистологическое и иммунофлюоресцентное исследование премоляра после проведения REP с длительной дезинфекцией каналов и положительной динамикой лечения. Зуб был удалён по ортодонтическим показаниям. Были исследованы сиалофосфопротеин (DSPP) – белок-предшественник, преимущественно экспрессируемый в одонтобластах; остеопонтин (OPN) – белок внеклеточного матрикса, обнаруженный в костях и зубах; периостин – неструктурный внеклеточный белок, играющий роль в развитии заболевания и заживлении и влияющий на клеточные взаимодействия; основной белок миелина (MBP) – белок играет ключевую роль в метаболизме и восстановлении нервов и продуцируется в больших количествах в Шванновских клетках.

Материалы и методы

Клинические процедуры

Девочка, 11 лет, обратилась в клинику с переломом зуба 29. Зуб невитальный, в области корня сформирован свищ (рис.1А). На рентгенограмме зуба 29 корень не сформирован, в области апекса разрежение костной ткани с нечёткими границами диаметром 3мм. Был диагностирован некроз пульпы и периапикальный абсцесс. У пациентки была диагностирована бимаксилярная протрузия, но родители не были заинтересованы в ортодонтическом лечении. Родителям были представлены возможности проведения апексификации и REP, пояснены преимущества и риски обоих методик. Было принято решение о проведении регенеративных эндодонтических процедур в отношении зуба 29.

Рис.1 А – Зуб 29 до проведения лечения: виден свищевой ход; В – рентгенограмма зуба 29 до лечения: наблюдается разрежение костной ткани в области апекса; C – Зуб 29 до проведения лечения: свищевой ход отсутствует; D – Рентгенограмма зуба 29 после проведения REP; E – Контрольный осмотр через год: отмечается дисколорит, зуб 29 серого оттенка; F – Радиограмма зуба 29 через год: в области апекса кортикальная пластинка прослеживается на всём протяжении, отмечается интраканальная кальцификация

После формирования доступа определено, что витальная ткань сохранена в области апекса на протяжении 2 мм. До этого уровня была проведена механическая обработка канала К-файлами с ирригацией 2% гипохлорита натрия. Далее проведено временное пломбирование корневого канала гидроксидом кальция. Через 2 недели свищевой ход всё ещё сохранялся. Были проведены те же процедуры, что и в первое посещение для химической дезинфекции корневого канала. Через три недели свищевой ход всё ещё функционировал, но уменьшился в размерах. Было принято решение о более инвазивной химико-механической обработке канала зуба 29. Это было необходимо для удаления биоплёнки на стенках канала, возможно оставшейся после проведённого ранее протокола дезинфекции, который был преимущественно химическим. Далее проведена минимально инвазивная инструментальная обработка К-файлами на всю длину канала. После этого корневой канал снова запломбирован гидроксидом кальция. Через 2 месяца во время четвёртого визита свищевой ход не был обнаружен (рис.1С). После проведения анестезии раствором Мепивакаина 3% проведена финальная ирригация гипохлоритом натрия 2% – 4 мл и ЭДТА 17% – 4 мл. Далее корневой канал высушен. Через микроскоп в апикальной части были обнаружены узелки кальцификации, которые возможно образовались в результате многократного использования гидроксида кальция. Кровотечения было вызвано предварительно изогнутым К-файлом. В коронковой трети канала для упрощения введения МТА использовали CollaPlug. Далее внесена прокладка Vitrebond, изготовлена окончательная композитная реставрация (рис.1.D). Через 1,5 года после проведения REP было принято решение о начале ортодонтического лечения и зуб 29 был удалён и сохранён для исследования.

Подготовка к гистологическому исследованию

Зуб после удалеия был помещён в 10% формалин на 48 часов для фиксации. Далее в течение 4-5 месяцев проводилась его декальцификация: конечная точка определялась рентгенологически. Зуб был сегментирован на 3 части: в корональной трети корня сагитально, в срединной трети – трансверзально, в апикальной – сагитально. Сегменты были обработаны и помещены в парафиновый блок для получения серии срезов (5мм). Срезы окрашены гематоксилин-эозином, по Брауну и Бренну (необходима для визуализации колоний микроорганизмов).

Иммунофлюоресцентный анализ

Парафиновые срезы очищены ксилолом, регидратированы, и помещены на ночь под натриевый цитратный буфер на 10мм при температуре 65С. Неспецифическая агглютинация проводилась с бычьим сывороточным альбумином. Для взаимодействия с первичными антителами препараты оставлены на ночь при температуре 4 С. Были применены антитела к DSPP, антитела к OPN, антитела к PSN и антитела к MBP. После этого срезы были инкубированы со вторичными антителами. Контрольные срезы получали только вторичные антитела без использования первичных антител. После окрашивания диамидинофенилиндолом срезы закрепляли флуоресцентным красителем и просматривали под конфокальным лазерным микроскопом.

Результаты

Клиническая картина

На контрольных осмотрах через 6 и 12 месяцев симптоматика не определялась, однако не отмечалась реакция при проведении теста на чувствительность. Отмечалось серое окрашивание шейки зуба (рис.1Е). На рентгенограмме через 12 месяцев наблюдалась интраканальная кальцификация в апикальной половине корня (рис.1F). Предоперационный очаг просветления уменьшился.

Гистологическое исследование

Пришеечная треть корня

На продольных разрезах (рис.2А) отмечалось нерегулярные отложения солей кальция, прилежащие к МТА (рис.2В,С и F) и окружённые витальными мягкими тканями  (рис.2G). Данная ткань состояла из фибробласт-подобных клеток и кровеносных сосудов без воспалительного инфильтрата. В канале и дентинных трубочках бактерии отсутствовали (рис.2D и Е). PSN был обнаружен в больших количествах в новообразованных мягких тканях, его количество сопоставимо с концентрацией в периодонтальной связке (рис.2I). PSN был локализован во внеклеточном матриксе (рис.2J). Большие концентрации OPN обнаружены по кальциотравматической линии (рис.2Н) и в клетках новообразованной мягкой ткани (рис.2К-М). DSPP находился в существующих ранее дентинных канальцах, стенках канала и дентиклях (рис.2L). Также вещество было обнаружено внутриклеточно в ассоциации с OPN (рис.2L и M). Небольшое количество клеток синтезировали в основном DSPP в своей цитоплазме, однако они не дифференцировали в полноценные одонтобласты (рис.2N).

Рис.2 Исследование сагитального среза цервикальной трети корня зуба 29 A – продольный срез зуба 29; B – окрашенный кальциевый барьер у МТА (МТА был удалён); C – участок, менее интенсивно окрашенный гематоксилин-эозином, отображает кальцифицированные отложения, прилегающие к границе МТА иподлежащим витальным тканям; D-E – высоко интенсивная модифицированная окраска по Брауну и Бренну: бактериальные колонии не выявлены, микроподтекания в композитной реставрации отсутствовали; F-G – гематоксилин-эозином интенсивно окрашены неструктурированный кальциевый осадок, прилежащий к витальным тканям, воспалительный инфильтрат отсутствует; H – иммунофлюоресценция низкой интенсивности отображает присутствие OPN (красный) в кальциевом осадке вдоль стенок канала и в слое цемента; I – низкоинтенсивная иммунофлюоресценция от PSN (фиолетовый) во вновь сформированной внутриканальной мягкой ткани, а также в тканях десны, прикрепленных к зубу № 29; J – внеклеточное расположение PSN (фиолетовый) во вновь сформированной внутриканальной мягкой ткани; K – увеличенный фрагмент рис.2Н: видна локализация OPN (красный) и DSPP (зелёный) вдоль стенки канала и в дентинных канальцах. Под белыми стрелками клетки в строме мягких тканей, совместно экспрессирующие OPN и DSPP; L – клетки внутриканальной мягкой ткани, окружающие кальцифицированный осадок (зелёный); M – фрагмент рисунка 2L: под белой стрелкой клетка, продуцирующая OPN (красный) и под прозрачной – клетка, синтезирующая OPN (красный) и DSPP (зелёный); N – увеличенное изображение фрагмента рисунка 2L: клетка, синтезирующая DSPP (зелёный).Вещество находится внутри клетки

Срединная треть

На поперечных срезах (рис. 3А) прослеживается вновь сформированная ассоциированная с дентином минерализованная ткань (DAMT), которая образовалась пристеночно в виде пластинчатой структуры, примыкающей к ранее существовавшему корневому дентину (рис. 3В). Участки мягких тканей и некротических масс располагались внутри и на поверхности DAMT, прилегали к дентину (рис.3B-D). От DAMT отходили отростки, проникающее в дентинные канальцы (рис. 3E). Образованная связь не была жёсткой: отростки проникали в дентинные трубочки не во всех участках (рис. 3F). В данной области не были обнаружены бактерии (рис. 3G). Тела клеток располагались в лакунах DAMT, в мягких тканях выявлено большое количество веретенообразных клеток, которые, предположительно, синтезировали кальцийсодержащее вещество (рис. 3J). В сформированных мягких тканях были обнаружены многочисленные сосудисто-нервные пучки (рис. 3N). Новые мягкие ткани, подобно тканям периодонта, синтезировали большое количество PSN. В области DAMT определялись низкие концентрации PSN (рис.3 I), OPN был обнаружен в кальцийсодержащем веществ и в слое цемента экстрарадикулярно (рис. 3Н). При бóльшем увеличении OPN в больших концентрациях определялся в проекции DAMT и по кальциотравматической линии (рис.3К и L). DSPP синтезировался в некоторых клетках новой мягкой ткани (рис.3М), однако по своей морфологии эти клетки отличаются от одонтобластов. MBP был выявлен в сосудисто-нервных пучках (рис.3О).

Рис.3 Исследование трансверзального среза срединной трети корня. A и B – вкрапления мягких тканей и некротических масс внутри DAMT и на его границе с дентином; C – срез средней трети зуба, окрашивание гематоксилин-эозин на небольшом увеличении; видны витальные ткани, окружающие DAMT; предположительно, DAMT не обладает адгезии к дентину и его связь с ним прерывается участками некротических масс; D – под открытой стрелкой некротические массы на границе дентина и DAMT E – сцепление нитевидных волокон, отходящих от DAMT, и дентина (окраска гематоксилин-эозин);F – разрыв связи DAMT и дентина (окраска гематоксилин-эозин); G – отсутствие микроорганизмов подтверждено окраской по Брауну и Бренну; H – расположение OPN (красный) преимущественно на границе раздела между DAMT и дентином; он также присутствует в кальциевых отложениях, а также в слое цемента на периферии зуба; I – расположение PSN (фиолетовый) преимущественно в недавно сформированной строме мягких тканей и внерадикулярном слое цемента / десны;J – участок рис.3Н, под белой стрелкой клетки DAMT, под прозрачной –веретенообразные клетки мягкой ткани; K – фрагмент рис.3Н, видно расположение OPN (красный) в дентинных канальцах и вдоль ранее существовавшего дентина; L – фрагмент рис.3К, показана клетка на границе дентина и DAMT; N – фрагмент рис.3К, показаны клетки DAMT; M – внутриканальная новообразованная мякая ткань, видны сосудисто-нервные пучки; O – MBP (желтый) в сосудисто-нервном пучке

Апикальная треть

На продольном разрезе (рис.4А) наблюдалось прорастание цемента с наружной поверхности корня в канал зуба (рис.4В и С). В области апекса была обнаружена остеоподобная структура с остеоцитами, находящимися в лакунах (рис.4D и Е). В канале был обнаружен атубулярный DAMT, прилежащий к ранее существовавшему дентину (рис.4К). В DAMT были обнаружены очаги некротизированной ткани, также присутствовали и участки минерализованного вещества (рис. 4L и N). Ориентация DAMT была прерывистой, нити вещества часто прерывались (рис. 4L и M). В некоторых областях DAMT было структкрировано (рис.4О). PSN был обнаружен экстрарадикулярно в новообразованных мягких тканях и в пространстве между новообразованным цементом и дентином (рис. 4G и J). Большие концентрации OPN определялись в остеоподобной ткани у апикального отверстия (рис. 4F) в проекции DAMT (рис. 4Р) и в клетках, находившихся в кальцификатах (рис. 4Q-S). DSPP был выявлен в остаточных количествах в клетках апикальной трети корня (рис.4S). Окрашивание MBP определялось в области апикального отверстия (рис.4Н и J).

Рис.4 Продольный срез зуба 29; A – продольный срез сегмента; B – образование цементоподобной ткани в апикальной области; C – фрагмент рис.4В; отображена неприрывность экстрарадикулярного цемента, врастающего внутрь канала; D и E – окраска гематоксилин-эозин, видны отложения апикальной ткани с лакунарно расположенными остеоцитами с разной интенсивность окраски в новообразованной кости; F – OPN (красный вокруг апикального отверстия и в слое цемента; G – распределение PSN (фиолетовый) во внутриканальных мягких тканях, приближено к уровню во внерадикулярном цементе и десне; H – распределение MBP (желтый) вблизи апикального отверстия; I – фрагмент рисунка 4 G, визуализируется PSN (фиолетовый) между новообразованным цементом и дентином; J – увеличенный фрагмент рис.4Н; MBP (желтого цвета) в мягких тканях апикально; K-M – новообразованные твёрдые и мягкие ткани в канале; N и O – новообразованные ткани с вкраплениями некротических масс; под открытой стрелкой – проникновение DAMT в дентин; P – OPN (красный) в проекциях DAMT, клетки находятся в DAMT; Q – увеличенный фрагмент рис.4Р; OPN (красный) и необнаружимые уровни DSPP (зеленый); R – увеличенный фрагмент рис.4К; границы раздела DAMT; клетки синтезируют низкие уровни ОРN (красный); S – фрагмент рис.4 R; клетка в матрице DAMT, которая синтезирует преимущественно OPN (красный) и скудные уровни DSPP (зеленый)

Обсуждение

В статье описан клинический случай успешного использования REP при лечении зуба с хронической инфекцией. Результаты проведённого гистологического исследования совпали с более ранними опубликованными исследованиями: ткани после проведения REP являются скорее репаративными, чем регенеративными. Наблюдалось образование связи между ранее существовавшим дентином и новыми минерализованными тканями. Неодонтобласт-подобные клетки в зависимости от их локализации синтезировали разное количество OPN и DSPP. Клетки, находящиеся около МТА, продуцировали DSPP и OPN. При более апикальном расположении –преимущественно OPN. MBP занимал центральное расположение в новообразованных тканях, однако отсутствовал в пришеечной трети корня. Большие концентрации PSN на всём протяжении корневого канала, что подтверждает активность репаративного процесса, а не регенерации.

В результате проведения REP произошла гистологическая репарация с утолщением стенок канала и уменьшием апикальной резорбции костной ткани. В данном клиническом случае предпочтительнее использование REP, а не апексификации. В результате проведения REP увеличивается длина и толщина корня, что важно при рассмотрении в долгосрочной перспективе. На успех проведённого лечения повлияли: этиология некроза пульпы, анатомическая аномалия, возраст пациентки, средняя ширина апикального отверстия.

По результатам исследования могут быть сделаны следующие выводы. В данном клиническом случае тяжесть инфекции могла объяснить результат гистологического исследования при проведении параллели с успешными случаями регенерации. С одной стороны, наши данные подтвердили эффективность использования гидроксида кальция: при окраске по Брауну и Бренну бактерии не обнаружены, таким образом, препятствия росту новых витальных тканей в пространстве канала отсутствовали. С другой стороны, продукты жизнедеятельности бактерий могут сохраняться в дентинных канальцах. Например, LPS может привести к остеогенному, а не одонтогенному пути развития стволовых клеток. Кроме того, созревание стволовых клеток в апикальной области могло быть изменено повторным воздействием CH и гипохлорита натрия. Эффект длительного воздействия CH был подтвержден обнаружением небольших апикальных кальцификаций, наблюдаемых до индукции кровотечения. Если учитывать различия в проведении лечения, неудивительно, что истинная регенерация, о которой сообщалось в некоторых исследованиях, здесь не наблюдалась. Кроме того, проводилось неспецифическое премещение клеток путем индуцирования кровотечения из периапикальных тканей вместо переноса специфических типов клеток: амплифицированных стволовых клеток пульпы зуба человека или стволовых клеток из молочных зубов человека, подвергшихся физиологической смене. Это может привести к появлению внерадикулярных стволовых клеток, запрограммированных для построения тканей периодонта или остеоподобных тканей.

Были использованы антитела к DSPP (белок-предшественник, который расщепляется, образуя нижестоящие эффекторные белки – сиалопротеин дентина и фосфопротеин дентина; последние участвуют в инициации и минерализации дентиновых матриксов) для идентификации одонтобластов. Была выявлена неоднородность неодонтобласт-подобных клеток, синтезирующих различные пропорции OPN и DSPP в зависимости от их локализации. Клетки, расположенные в пришеечной трети, предположительно секретировали как DSPP, так и OPN; расположенные апикально – преимущественно OPN. Одонтобласт-подобные клетки синтезировали OPN, в т.ч при повреждении пульпы. DSPP не является специфическим одонтобластическим маркером, однако его экспрессия обычно выше у одонтобластов. Хотя клетки в пришеечной трети синтезировали как OPN, так и DSPP, у новообразованных мягких тканей отсутствовала типичная морфология одонтобластов – распространение отростков в дентинные канальцы. Таким образом, не произошло регенерации пульпо-дентинного комплекса.

Нитевидные отростки присутствовали в DAMT, который связывался с ранее существовавшими дентинными канальцами, что было подтверждено в более раннем исследовании на собаках. Интенсивное окрашивание OPN, гликопротеина свидетельствует о высоком содержании коллагеновом и низком содержании минералов, подобных предентину. Это неудивительно, потому что OPN уменьшает образование и рост кристаллов гидроксиапатита. При проведении лечения необходимо добиться механического укрепления тонких стенок канала, однако связь DAMT с дентинном слабая.

В данном исследовании для определения развития нервной ткани использовали анти-MBP, наличие нервной ткани было подтверждено, как и в более ранних исследованиях на человеких зубах. Наличие функциональных нервных волокон важно: чувствительность пульпы участвует в механизме её защиты от травм. Средняя и апикальная трети окрашены положительно для MBP. Это соответствует выводам о том, что зрелые Шванновские клетки обычно находятся глубоко в пульпе зуба. Известно, что в норме немиелинизированные волокна проходят через слой одонтобластов в дентинные канальцы. Недавно было доказано, что эти волокна обнаруживаются в зубах после проведения REP.

В ходе исследования были подтверждены более раннее исследование на собаках, демонстрирующее экспрессию PSN в новообразованных интрарадикулярных мягких тканях после проведения REP. PSN изначально был назван остеобласт-специфическим фактором, но был переименован из-за его обилия в надкостнице и в периодонтальной связке. Его синтез происходит в зубном сосочке и пульпе во время формирования зуба. PSN сохраняется в субодонтобластическом слое и в периодонтальной связке у зрелых зубов. Он может быть обнаружен в различных тканях и образуется при системных заболеваниях, связанных с хроническим фиброзом. PSN играет важную роль в первоначальном ремоделировании после травмы, но хроническое повышенные его уровня могут свидетельствовать о патологической реакции организма хозяина. PSN значительно повышается за счет трансформации фактора роста beta 1, фактора роста, высвобождаемого при кондиционировании EDTA и пломбировании гидроксидом кальция, что было применено в данном клиническом случае. Исследование in vitro также показало активацию PSN при культивации фибробластов десны и периодонтальной связки с MTA, который ограничивал пульпу. PSN является негативным регулятором минерализации, одонтобластической дифференцировки – его длительное присутствие может быть нежелательным для регенерации. Для определения влияния PSN на регенерацию тканей необходимо проведение дополнительных исследований.

В данном клиническом случае был использован гидроксид кальция и ЭДТА, что повышант экспрессию DSPP, однако синтез DSPP был обнаружен только в коронковой части зуба. Способность МТА индуцировать продукцию DSPP ранее была доказана в исследовании in vivo. Предположительно, микросреда, на которую влияет присутствие MTA, вызывает относительное увеличение синтеза DSPP только в тканях, находящихся вблизи этого материала.

Клинические методы и материалы, используемые во время REP, были в значительной степени основаны на рекомендациях исследований in vitro и на исследованиях на животных. Для этих двух видов исследования необходимо изучение влияния смешанной микрофлоры и влияния отдельных видов микроорганизмов на состояние девитальных зубов. Хотя некоторые ожидаемые эффекты от доклинических экспериментов in vitro и на животных можно наблюдать при клинических исследованиях, регенерация пульпы de novo ограничена сложным взаимодействием факторов ответа хозяина, например, высоким уровнем PSN, как в данном случае.

ВЫВОД

В данном клиническом случае показана важность протоколов дезинфекции для достижения успеха при проведении REP, хотя при гистологическом исследовании определялась репарация, а не регенерация. Будущие исследования в этой области должны быть направлены на более детальное исследование заживления ран после проведения REP. Это необходимо для лучшего контроля результатов лечения.

Источник: Journal of Endodontics

Перевод с английского языка Станкевич Е.В., Ковшик Е.В. для портала BELODENT.ORG